ハイブリッド顕微鏡は完全な3Dビューを提供

March, 5, 2025, Chicago--米国シカゴ大学の研究成果によると、蛍光分子の位置だけでなく、蛍光分子の配向を測定することで、動的な細胞構造に関する洞察を明らかにすることができる。
蛍光異方性イメージングは半世紀以上前から存在しているが、既存技術は2次元のみ、またはまばらに標識された単一分子サンプルの測定に限定されていた。

現在、米国の研究者は、蛍光分子の集団の完全な3D方位と位置を評価できるハイブリッド顕微鏡を作成した(Proc. Natl. Acad. Sci., doi: 10.1073/pnas.2406679122)。偏光蛍光技術とデュアルビューライトシート顕微鏡を組み合わせたこの顕微鏡は、3Dタンパク質の配向変化や分裂細胞の紡錘体内の分子などの現象を記録することができる。

「われわれは、細胞生物学と生物生物学全体に応用できる可能性を見ている。われわれの顕微鏡は、蛍光プローブの3D向きがアクセスが困難な生物学的情報を報告できる場合に価値を提供できる」と、シカゴ大学の大学院生として研究を行った研究著者のTalon Chandler(CZ Biohub San Francisco)は話している。

機器の統合
蛍光分子の大部分が双極子エミッタであるため、偏光は選択的な励起と検出に使用できる。その後、生物学者は光学顕微鏡を使用して蛍光色素分子の励起パターンと蛍光パターンを調べ、その位置と向きの両方について結論を導き出す機会がある。

蛍光異方性イメージングの従来の方法は、配向パラメタのサブセットを測定することに限定されていた。最近の単一分子技術では、3次元の位置、方位、回転ダイナミクスを評価できるが、蛍光分子のアンサンブルには適用できない。

Chandlerとチームは、偏光顕微鏡とデュアルビューライトシート顕微鏡という2つの異なる技術を統合して、分子の集合体の3D配向と位置を捉えることができるハイブリッドデバイスを開発した。特に、デュアルビューライトシート顕微鏡には、多様な照明と検出偏光を可能にする2つの励起アームと検出アームがある。

「われわれの知る限り、この顕微鏡は、サンプルを密に標識する蛍光分子の3D位置と3D配向を同時に測定した最初の顕微鏡である」(Chandler)。

検証とスピードの必要性
偏光デュアルビュー倒立選択面照明顕微鏡(pol-diSPIM)は、非対称の対物レンズのペアで構成されており、それぞれが励起と検出が可能である。最初の対物レンズは偏光ライトシートでサンプルを照らすために使用され、2番目の対物レンズは体積を画像化するために使用される。次に、対物レンズの役割が入れ替わる。

次に、研究チームは、様々な偏光照明の下でこれらの体積取得を繰り返し、計算イメージング技術を活用して、生データからできるだけ多くの情報を復元する。チームは、ナノワイヤグリッド上で増殖する細胞の巨大な単層小胞、セルロース、およびアクチン細胞骨格をイメージングすることにより、pol-diSPIMを実証、検証した。

「われわれの顕微鏡は、5秒ごとに3Dの位置と3Dボリュームを画像化するため、生物学者が研究する多くの生命プロセスを画像化するのに十分な速度ではない。より迅速な検出と改善された偏光サンプリングパターンを備えた改良されたバリアントになると、有用になる」とChandlerはコメントしている。